Embora o mundo microscópico faça parte do nosso cotidiano de forma íntima, enxergar vírus, bactérias e até mesmo as estruturas moleculares que mediam suas interações – entre si e com o corpo humano – ainda é um dos grandes desafios da ciência. Nas últimas décadas, porém, essa barreira vem sendo superada com o avanço da criomicroscopia eletrônica, ou cryo-EM, uma ferramenta que permite observar, em detalhes, estruturas milhares de vezes menores que uma bactéria que sustentam a vida em escala molecular. No Brasil e no mundo, essa abordagem tem sido aplicada na investigação de processos fundamentais, com impactos que vão da compreensão básica dos sistemas biológicos ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas com potencial transformador para a saúde.
A cryo-EM pode revelar desde proteínas até vírus inteiros
A cryo-EM é uma técnica avançada de microscopia que combina o congelamento ultrarrápido de amostras biológicas, sua visualização em microscópios de alta precisão e a reconstrução computacional das estruturas, resultando em imagens com altíssimo nível de definição. A abordagem, reconhecida com o Prêmio Nobel de Química em 2017, possibilita observar moléculas próximas de seu estado natural, sem a necessidade de modificações extensas e com menor risco de danos. Por isso, é uma ferramenta poderosa para compreender processos biológicos em andamento e desvendar a organização tridimensional das estruturas que os suportam.
As vantagens da criomicroscopia eletrônica impulsionam sua aplicação em uma ampla variedade de contextos, que vão da observação de proteínas isoladas a sistemas complexos envolvidos na motilidade e secreção bacteriana, além da análise de vírus completos. Nesse cenário, diferentes grupos de pesquisa têm explorado o potencial da técnica para responder questões cada vez mais específicas sobre o funcionamento de sistemas biológicos. É o caso do Centro de Pesquisa em Biologia de Bactérias e Bacteriófagos, o CEPID B3, uma rede brasileira de pesquisadores sediada na Universidade de São Paulo (USP) e financiada pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).
Gabriel Araujo, pós-doutorando no CEPID B3 e especialista em técnicas de cryo-EM, explica que diversos grupos filiados ao Centro têm utilizado a abordagem em seus projetos, especialmente no que diz respeito à análise de proteínas dos bacteriófagos, ou fagos – tipos especiais de vírus que só infectam bactérias e podem ser utilizados como terapias alternativas aos antibióticos. “Em um dos projetos, estamos avançando no uso da cryo-EM para reconstruir proteínas da cauda do fago que se ligam ao receptor na célula bacteriana”, aponta o pesquisador. “Isso pode nos ajudar a entender quais hospedeiros ele consegue reconhecer e infectar, além de dar pistas sobre o desenvolvimento de resistência bacteriana por mutações e alterações nesses receptores”, explica.
As amostras são congeladas a quase 200 graus negativos
O caminho entre a obtenção da amostra de interesse e a interpretação dos resultados exige diversas etapas minuciosas que começam bem antes dos microscópios. Primeiro, os materiais passam por por uma série de preparos bioquímicos, seguidos por um processo delicado de congelamento. “Precisamos testar diferentes condições de congelamento para conseguir os parâmetros adequados para cada coleta”, explica o pesquisador. “Isso é feito aplicando as soluções com as amostras no que chamamos de grades, que são telas circulares muito finas e com só 3 milímetros de diâmetro”, acrescenta. As grades são revestidas com um filme especial de carbono repleto de pequenos buracos, dentro dos quais as proteínas da amostra devem se distribuir.
O congelamento precisa ser quase instantâneo para evitar que a água presente na mistura se cristalize e crie interferências que poderiam atrapalhar as observações. “Para se obter o chamado gelo vítreo, a grade precisa ser mergulhada imediatamente pelo aparelho no chamado banho criogênico, extremamente frio”, afirma Araujo. Desse momento em diante, todo o material passa a ser mantido em temperaturas próximas de 196 graus negativos. A camada de gelo resultante deve ser extremamente fina, lisa e o mais transparente possível.
Com as amostras prontas, congeladas e com a identificação de que o preparo foi adequado, o trabalho segue para a observação em microscópios potentes e especializados, onde cada proteína presente na amostra será fotografada centenas de vezes em diferentes ângulos e posições. Alguns dos aparelhos utilizados nessa etapa chegam a medir quase 3 metros de altura. “Até mesmo a própria sala do microscópio precisa de cuidados especiais para isolar interferências externas, existe toda uma engenharia dos pisos para garantir maior estabilidade”, diz Araujo. As análises do CEPID B3 são realizadas no Laboratório Nacional de Nanotecnologia (LNNano), em Campinas. A coleta de dados é automatizada e pode durar dias. Milhares de imagens são geradas, somando terabytes de informação. “Mas, para o processamento dos dados, este é apenas o início”, ressalta o pesquisador.
O próximo passo depende de um intenso trabalho computacional de identificação, alinhamento, sobreposição de imagens e combinação de informações até a formação de reconstruções tridimensionais das amostras analisadas. Somente após essa etapa, especialistas, como Araujo, podem começar a interpretar os dados obtidos, refinando modelos moleculares, identificando a posição e as interações entre os aminoácidos – as partes que formam as proteínas – presentes na amostra e investigando a implicação das novas informações no estudo dos sistemas biológicos em foco.
A combinação com novas tecnologias amplia o potencial de gerar informações ricas e completas
Os aminoácidos poderiam, em princípio, assumir diversas conformações entre si durante a formação das proteínas. No entanto, devido às interações entre eles e com o meio aquoso, acabam se organizando em estruturas tridimensionais específicas. Hoje, métodos computacionais permitem prever quais dessas estruturas tendem a se formar em determinadas condições. Essas previsões facilitam a aplicação dos dados obtidos com a criomicroscopia eletrônica. “Com um bom modelo 3D predito, como os gerados pelo sistema de inteligência artificial AlphaFold, torna-se muito mais fácil encaixar as cadeias proteicas nos mapas obtidos e refinar as estruturas com dados experimentais”, explica.
Apesar de sua complexidade, a criomicroscopia eletrônica apresenta vantagens importantes em relação a outras técnicas de biologia estrutural. “Em geral, ela requer uma quantidade menor de amostra”, observa Araujo, o que é especialmente útil para materiais de difícil obtenção. Além disso, permite observar as proteínas em solução, em condições mais próximas das naturais.
Outra vantagem é a capacidade de visualizar diferentes conformações de uma mesma proteína dentro de uma única amostra. “Em vez de isolar um único estado, podemos separar computacionalmente diferentes partículas e obter reconstruções distintas”, explica o pesquisador. Isso amplia significativamente as possibilidades de análise.
O futuro da cryo-EM
Em entrevista ao Jornal da Unicamp, Leonardo Talachia Rosa, pesquisador do CEPID B3 que também conduz estudos com a técnica, destaca que a cryo-EM já tem impactos práticos que alcançam até mesmo a saúde humana. De acordo com ele, compreender como as proteínas se organizam no espaço e exercem suas funções biológicas permite projetar fármacos mais precisos, que podem ser programados para se ligar a regiões específicas das proteínas, inibindo ou modificando sua atividade e combatendo mecanismos como a resistência bacteriana.
Araujo reforça que, mesmo com os avanços recentes, o campo segue aberto para inovações e sugere que, nos próximos anos, a técnica pode se tornar ainda mais eficiente. “Um dos grandes gargalos atuais da técnica é o preparo das amostras, porque é difícil conseguir regiões nas grades com gelo fino o suficiente para fazermos as imagens”, diz. “Muitas proteínas também têm a tendência de apresentar comportamentos indesejados durante o congelamento, como grudar no carbono ou não se distribuir no gelo”, acrescenta. Ele defende que uma das formas propostas para tratar alguns destes problemas é automatizar o preparo das grades, tornando o processo muito mais rápido, na escala de frações de segundos. “A ideia é, basicamente, congelar a amostra antes que esses fenômenos indesejáveis tenham tempo de acontecer”, explica. A ideia já vem sendo abordada por diversos grupos de pesquisa ao redor do globo e alguns modelos comerciais já estão disponíveis.
“Também esperamos avanços na crio-tomografia eletrônica, trazendo a biologia estrutural para situações muito mais complexas dentro de ambientes celulares”, aponta Araujo. Essa abordagem, uma variação da cryo-EM, permite reconstruir grandes complexos diretamente no interior das células. A principal diferença está na forma de obtenção das imagens: “enquanto em cryo-EM obtemos a informação tridimensional combinando partículas que aparecem em diferentes orientações nas imagens, em crio-tomografia eletrônica nós repetidamente registramos os mesmos objetos, mas inclinando progressivamente a amostra de forma a vê-los em diferentes ângulos”, diz o pesquisador. “O Brasil ainda está em estágio inicial nesse tipo de aplicação, mas alguns grupos já avançam na coleta de dados com essa metodologia”, afirma. Para ele, o campo ainda está longe de atingir seu limite. “Existe uma grande margem para avanços, tanto nos microscópios quanto nas estratégias de processamento”, conclui, deixando claro o potencial de expansão do que conseguiremos ver com a cryo-EM, dentro e fora das células, nos próximos anos.
